StemCellsChangeLives
細胞改變生命
本文经授權轉自公眾號“間充質幹細胞”
文字\?東海先生
本文僅作科普參考
間充質幹細胞（MSC）是臨床應用的明星之一，已經有很多間充質幹細胞能治療多種疾病的新闻报道。
影響MSC的療效，有很多因素，本文主要討論MSC相關的關鍵影響因素；其他影響因素還包括患者的疾病類型和醫生的醫療科技和醫院的整體實力水平等等。
冻存的间充质干细胞电镜照片
MSC相關的關鍵影響因素：細胞質量、注射途經、最佳劑量、治療時機。
這四個因素，目前還沒定論！但隨著研究的發展，卻是越來越明朗。
（一）細胞質量
不同廠家生產出來的同一種藥物，質量之間存在一些差异，尤其是進口藥和國產藥相比較，我相信大家都沒什麼意見。同樣的情况也存在不同的幹細胞公司。
只是幹細胞行業的情况更複雜，更不規範。非常期待國家頒發指南或指導檔案來規範這個行業。
先來大概定義一下“細胞質量”指的是什麼
我認為細胞質量指組織細胞或單個細胞所對應的生物學效力；效力越高，細胞質量越好。那麼，什麼是生物學效力（BiologicalEfficacy，也可以縮寫為bio-efficacy）？
先來理解什麼是效力，英文單詞是efficacy，不是effectiveness，effectiveness指效果。效力包括强度（strength）和效果（effectiveness）兩個因素，即相同强度（一般指濃度）下所取得的效果。
比如，路人甲一天能搬2噸的磚頭，但一天只能寫一段SCI英文句子。路人乙一天能搬1噸的磚頭，但一天能寫三段SCI英文句子。
那麼在搬磚頭方面路人甲的效力就高於路人乙，在寫SCI英文句子方面路人甲的效力就低於路人乙（假設每段SCI英文句子的字數一樣）。
囙此，我們談效力的時候，一定是要明確到做具體的事情。效力這個概念廣泛用於生物界，包括殺蟲劑、藥物。
這個概念也引用到幹細胞領域。比如《幹細胞制劑質量控制及臨床前研究指導原則（試行）》就提到生物學效力試驗用於判斷幹細胞製劑與治療相關的生物學有效性。
囙此，討論MSC的細胞質量或生物學效力，就離不開具體的適應症。我們應該在一個適應症範圍內談論這個效力如何如何。
比如，MSC同時具有免疫抑制和促進血管再生的功能，分別治療兩大類不同的疾病，那麼相對應的就有兩個生物學效力名額。
但是，現在的MSC基礎和臨床研究尚未進入這個細分的領域，這裡就籠統的談一談細胞質量和哪些因素相關。
有一些參數可以反映間充質幹細胞的質量，比如細胞活率、供體特性（1,2）、尅隆形成能力（3,4）、細胞大小（5）、免疫抑制能力（6,7）和細胞因數分泌量（8-10）。
1、細胞活率（cellviability）
這個好理解。就是MSC進入人體之前，MSC針劑裏還有多少MSC是活的？
在文獻中明確提及MSC的細胞活率的情况不多見。不同的臨床研究所用的細胞活率有所不同，細胞活率有80%（11-13），有85%（14-16），有88.2±6.1%（17），有90%-97%（18），有92%（19），有95%（20-22），還有存在70%的情况（23-25）。
不少國外的文章提到的細胞活率低於90%，所以別慣性思維地認為國外的幹細胞質量就是好。
活率90%以上的細胞製劑和活率只有70%的細胞製劑，相同的疾病情况下，治療效果難免會有較大的差异。
畢竟，MSC需要活著，而且還要扛過肺部的清除，才能很好地發揮治療作用。所以，細胞活率真的很重要！
2、供體特性
供體特性包括“供體年齡”和“供體的身體狀況”。
（1）供體年齡
供體年齡是一個很重要因素，因為來自年輕供體的MSCs似乎具有更大的活力、增殖潜力和抗氧化能力，而年齡較大的成年來源的MSC具有較低的增殖能力（1,26，27）。
從年齡上來講，臍帶、臍帶血和胎盤應該最具優勢，乳牙牙髓次之，而骨髓和脂肪就相對年齡大點了。
我個人非常不建議45歲以上的人群作為MSC的供體去抽骨髓和吸脂肪來獲取MSC。
年齡越大，在骨髓中的幹細胞就越少：
剛出生時，骨髓1萬個單個核細胞中就有1個是MSC；30歲時，MSC的數量減少到骨髓25萬個單個核細胞中才有1個MSC；到80歲時，MSC的數量就更少了，骨髓萬個單個核細胞才有1個MSC。
性別可能對MSC的某些功能有影響。比如有研究顯示女性來源的MSC表達更高水准的IFN-γR1和IL-6β，從而具有更强的免疫抑制能力（28）。
那麼，不同來源之間的MSC有什麼功能特性上的差异？
不同組織來源的MSC具有某些差异性，主要體現在MSC的增殖速度、分泌的細胞因數譜和免疫調節能力。
（2）供體的身體狀況
有不少研究證明疾病也會影響自體間充質幹細胞的功能，尤其是一些自身免疫性疾病患者，其自身骨髓的MSC出現功能异常，包括增殖速度减慢、尅隆形成能力降低、免疫抑制能力下降、分泌生長因數的數量減少等等病理變化，使得患者自身骨髓MSC不適合用於自己疾病的治療。
理論上，有可能存在某種先天性基因變異，導致MSC的功能出現缺陷，那麼患者出生時的臍帶、臍血和胎盤來源的MSC也不適合自體治療。但是，目前還沒見到這樣的文章報導，只是理論上存在這種可能性。
是不是所有的患者骨髓MSC都有病變？估計也不是，可能疾病早期，患者骨髓MSC的功能並未受到損傷。
先有疾病，後導致骨髓的MSC出現功能缺陷？還是先出現MSC的功能缺陷，後導致疾病的發生？這是一個很有意思的課題，有待科學家們的努力。
（二）注射途經
MSC在人體內分佈的研究數據極少，估計是考慮到標記物的安全性問題。
1、靜脈注射（全身性輸入）
靜脈注射是最常用和最簡單的途徑，並且允許輸入大量的MSC。
靜脈注射最大的弊端就是肺部能清除超過60%的MSC，造成趨化到損傷部位發揮治療作用的MSC數量減少。這是為何？
肺血管系統的特性，允許直徑小於5μm的微粒或細胞完全通過，而阻擋大部分直徑超過20μm的微粒或細胞（1）。人臍帶來源的MSC細胞直徑大部分集中在14-20μm的範圍（見下圖）。
人臍血來源的MSC比人骨髓MSC容易通過肺臟，而且年齡越大的供體，其骨髓MSC越容易在小鼠肺部滯留；在肺部滯留的MSC細胞數量，與MSC細胞表面表達的綜合素α4和α6密切相關，表達量越高，越不容易在小鼠肺部滯留（2）。
但是，如果MSC聯合綜合素抗體給患者使用，那麼需要評估綜合素抗體靜脈注射所帶來的風險。
在兩項小型人體臨床研究中，使用銦標記的MSC外周靜脈輸入患者體內，儘管早期在肺部發現了大部分訊號，但48小時後大部分訊號轉移到脾臟和肝臟（3，4）。
MSC靜脈輸入體內10天后，至少尚有約50%的MSC存留在體內發揮作用，而肺部只有不到5%的滯留量（3）（見下圖）。
囙此，我們不能單獨依靠動物研究，需要結合臨床研究來優化MSC的最佳治療方案。
有意思的是，給大鼠靜脈注射MSC後，96小時後給與檢測，低氧環境新增MSC在肺部的滯留，而减少MSC在肝臟、脾臟和腎臟的數量（5）（見下圖）。
以此看來，患者使用MSC時，最好是提高肺部的血氧分壓，至少是正常氧氣含量的環境裏。
2、局部介入注射
局部介入注射，包括聯合生物資料的應用（例如用於矯形障礙的骨支架）、用於神經系統疾病的脊髓鞘內注射、用於呼吸系統疾病的氣管內注射，都有利於MSC避開肺部的清除。
（1）、脊髓鞘內注射
MSC應用的另一個常見輸入途經是脊髓鞘內注射。
MSC的脊髓鞘內注射常見於治療神經病變類疾病，包括中風、腦癱、自閉症等，並且此科技亦可以應用於大多數兒童（包括早產兒）。
據報導，臍帶來源的MSC鞘內注射到8對伴有腦癱的雙胞胎患兒，所有患者間隔3-5天接受4次鞘內注射，每次（1.0-1.5）×10e7個MSC，經治療6個月後運動功能明顯改善（6）。
另一臨床研究顯示異體MSC進行靜脈和/或鞘內注射，可以提高腦癱患兒的肌張力、力量、語言、記憶、認知能力等（7）。
全身麻醉下鞘內注射MSC時，會出現與輸注相關的不良反應，發燒和嘔吐最常見，甚至出現比較嚴重的癲癇發作；
但所有症狀在72小時內自發消退，在6個月的隨訪期內沒有出現進一步的併發症。有推測發燒和嘔吐可能與全身麻醉有關。
（2）、腦實質內微注射
在MSC治療腦癱的臨床研究中，研究者評估了鞘內注射聯合腦實質微注射MSC治療腦癱的可行性和有效性（8）。
在這個臨床研究中，自體骨髓MSC在體外培養至4-5代，每次注射使用2X1e7的MSC劑量；
所有患者均接受鞘內MSC，但年齡較大或頭顱較大的患者（5歲或頭圍50cm或更大），先接受2次鞘內注射，再進行立體定向手術接受了腦實質內MSC微注射治療；
所有患者的總運動功能評分均有不同程度的提高，但腦實質內微注射並未帶來額外的益處。研究者只是觀察到短暫的低溫和傷口疼痛，但沒有更嚴重的不良事件。
骨髓MSC在大腦缺血區域周邊局部注射治療中風（發病超過6個月）的臨床研究，共18名患者，所有患者不開展康復治療，經過1年的觀察和評估（ESS、NIHSS、mRS和F-M總評分和運動功能評分），各種評分得到改善；
但是，所有的患者都出現了不同程度的由於局部注射導致的副作用（經分析和MSC無關），包括頭疼、噁心嘔吐、抑鬱、肌張力增高、疲勞、血糖升高、C反應蛋白升高（9）。
所以，謹慎考慮腦局部微注射MSC這種治療管道！
（3）、氣管內注射
早產兒常伴隨著支氣管肺發育不良（BPD）的風險。一個小規模的臨床實驗驗證MSC干預早產兒BPD的可行性（10）。
這9名平均妊娠25.3周的早產兒的平均體重為克；前3名BPD患兒的MSC劑量為1X1e7/kg，後6名BPD患兒的MSC劑量為2X1e7/kg；
治療7天后，支氣管分泌液中的炎症因數濃度明顯下降，呼吸嚴重程度評分（RespiratorySeverityScore）改善明顯。
發生BPD風險的嬰兒通常需要在出生時或出生後不久進行氣管插管以進行機械通氣和表面活性劑替代治療，為MSC治療提供了簡便的輸入途徑。
然而，目前的臨床實踐是在嬰兒的醫院療程（通常是幾天）中比在歷史上（數周至數月）更早地移除氣管導管。
在這種情況下，MSC的靜脈注射可能是氣管內輸入的可接受的替代方案，因為即使靜脈輸入MSC，MSC也可能被“捕獲”在肺血管系統中。
（4）、結合生物支架
幹細胞結合生物支架治療難治性疾病，尤其是神經損傷性疾病，是一個新的治療手段。
有報導使用自體骨髓MSC聯合脫礦骨基質支架，3個月後能實現約50%的骨缺損填充，不適合普遍臨床應用（11）。
另外，也有研究顯示在沒有骨支架的情况下實現了79.1%的填充，但使用的MSC在體外經過成骨誘導的培養處理（12），表明細胞比其支持結構更重要。使用供體骨作為生長刺激因素可能有助於MSC用於顱骨重建（13）。
（三）最佳劑量
MSC的最佳劑量取決於不同的疾病和嚴重程度以及輸入途徑。
在MSC的臨床研究和應用中，細胞劑量可能屬於最無厘頭的和最體現不出科學性的一個環節了，即使有一些臨床研究涉及劑量爬坡實驗，但也不是基於動物實驗的基礎。
由於MSC和傳統藥物的特性差异巨大，具體表現至少有2點：
①在MSC進入體內後，不符合傳統藥物典型的分佈和代謝模型；傳統藥物屬於被動分佈，而MSC具有主動趨化到損傷部位的功能，MSC在健康機體和疾病機體的體內分佈也不一樣。
②傳統藥物的動物實驗需要多次給藥維持穩定的血藥濃度，而MSC的動物實驗常常是單次注射，以至於MSC的臨床研究也常常採取1次注射的方案。
實際上，MSC的單次注射並不能取得良好的穩定的長期的治療效果，即使短期內有明顯改善。
對於某種疾病，在臨床前的研究中，動物實驗並沒有充分證明MSC起效的最低劑量和最大飽和劑量，而且不同實驗室的細胞劑量存在差异。
不同實驗室的培養系統、MSC的來源内容等因素，常常導致MSC的質量存在差异，直接影響了MSC的動物實驗和臨床研究的結果[1]（見下圖）。
囙此，MSC的臨床前研究的數據並不能很好地指導臨床研究的方案確定。
在目前的臨床研究中，MSC的使用劑量範圍非常大，每名患者使用的MSC細胞數從四千多個MSC到上億個MSC不等。
局部介入的治療管道，最低的劑量出現在MSC治療股骨頭壞死的臨床案例中，韓國和法國各一項臨床研究用量為多個MSC[2,3]。
介入治療最高的劑量出現在中國的一項臨床研究，為MSC治療糖尿病肢體大皰病，細胞用量為8.6億[4]；第二高劑量為2億個MSC心肌注射[5-8]。
局部注射的MSC用量超過1億的臨床研究還有：1.2億MSC治療克隆氏病腸瘺[9]、1億MSC關節腔注射治療膝骨關節炎的[10-12]、1億MSC治療缺血性心肌病[13]。
靜脈輸入的細胞劑量相對比較穩定，常常採用每公斤體重數百萬級的MSC，即（1-10）x1e6/kg。
靜脈輸入最高的劑量為與造血幹細胞造血幹細胞共移植的10x1e6/kg[14]，按照60公斤的體重，那也是需要6億個MSC了；還有治療GVHD的8x1e6/kg[15,16]。
靜脈輸入最低的劑量出現在MSC和造血幹細胞共移植的臨床實驗中，為0.3x1e5/kg[17]。
9年Prochymal（骨髓MSC）治療難治性GVHD的3期臨床試驗的失敗，是MSC臨床應用的一個災難性事件，幾乎否定了MSC的臨床療效[18]。
Prochymal來源於健康人的骨髓，而MSC本身具有很强的免疫抑制能力，然而，為何Prochymal卻在3期臨床試驗中因療效不能明顯優於對照組？
當時Prochymal的適應症為激素抵抗性難治性GVHD，本身這個適應症就是非常棘手，如果Prochymal不優化治療方案，尤其是劑量方面突破常規思維，那麼失敗在所難免。
後來提高MSC細胞劑量到5x1e6/kg和8x1e6/kg，治療激素抵抗性難治性GVHD的效果優於9年之前的療效，使得英國和歐盟的治療指南推薦MSC作為治療2-4級急性GVHD的三線治療藥物。但是Prochymal依然未得到美國FDA的認可。
有意思的是，年有一篇Meta分析的文章提出“劑量”這個因素並未影響MSC治療急性GvHD患者的生存率[19]。
雖然有專家認為5x1e6/kg和8x1e6/kg為高劑量，但是目前尚未對何種劑量定義為“高劑量”進行討論和證明。
如果把MSC看作為“藥品”，那麼肯定存在一個範圍，在這個範圍內，劑量越高效果越好；然後達到一個飽和劑量後，繼續提高細胞劑量，並不能帶來更多的療效，反而可能帶來一些不良反應。
文獻分析標準：
①臨床研究文章來源於pubmed和clinicaltrials；
②只分析臨床研究中是用“間充質幹細胞（MSC）”的文章，不採用骨髓或臍帶“單個核細胞（MNC）”的文章。
本文观点仅供科普参考